构建载体时为什么用双酶切而不用但酶切
1、所以现在的技术多采用双酶切，即目的基因两端的粘性末端不同，从而防止反向连接和自身环化，有效提高形成重组DNA的效率。
2、双酶切之后，由于用的两种酶切出来的粘性末端序列不一样，所以一般载体不会再自连。而你说的载体和基因片段再重新连起来，也是不太可能的，因为连接反应是需要ATP提供能量的，酶切体系里面没有ATP，所以不会再连接。
3、我认为第一次连应该是用于目的基因的扩增，毕竟PCR出来的目的基因量不是很足。第二次用双酶切切下目的基因，同时切的第二个载体是用于构建载体用的，双酶切后就将目的基因和用于构建的载体连接起来。
原核表达载体的原核表达载体调控原件
顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。
载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
IPTG在作为诱导剂参与原核表达的进程，单其本身并不被消耗。
为什么对重组质粒DNA进行双酶切
\验证重组质粒的构建是否成功，如果成功了，电泳应该是载体片断和插入序列两条条带，分别对应应有的长度。
补充一点就是看看你的片段是否有这个酶的酶切位点。尽管有些好笑，但是有人确实犯过这样的错误。你提取的质粒浓度很低的话，在酶切的时候就少加点水多加点质粒。不然浓度低当然看不见。
用限制性内切酶切割DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶切为后续工作提供了有效的实验材料。限制性内切酶是细菌体内限制修饰系统内部切断的内切酶。根据限制性内切酶的特性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型。
切割后能产生相同的黏性末端，末端彼此间可以发生碱基互补配对，从而形成重组DNA分子。所以当用两种不同限制酶也就是双酶切，分别切割含目的基因的DNA片段和质粒，能够防止发生目的基因与质粒自身连接体，充分克服单酶切的缺点。
构建重组质粒时是只用同种限制酶切割目的基因和载体吗?
1、是的，必须的。因为同种限制酶的碱基序列相同，目的基因与运载体重组后必须用同种限制酶，它们的碱基序列才会相同。
2、没错，只有用同一种酶处理，载体和目的基因两端才会形成相同的粘性末端，才能把两者连起来。
3、对。这样才能产生相同的粘性末端，才能将目的基因与质粒连接起来形成重组质粒。
4、一般情况下是的，因为只有这样才能有相同的黏性末端，目的基因和运载体才能重组。但也有两种不同的内切酶产生相同的黏性末端如G↓ATTCG 和↓ATTC。
在基因工程中,用双酶切目的基因和质粒时怎么保证目的基因和载体的定向连...
1、“两条目的基因的1处粘性末端不也可以链接吗？”，当然存在这种可能性。但用两种限制性内切酶切割最主要的目的是防止载体切割后的自连，几率不但大，而且可以产生克隆，大量的自连会影响挑选重组的克隆。
2、所以就能使目的基因与质粒准确结合，进行定向、定点克隆，这个克隆方法还有一个优点，就是效率高，因为没有了载体自连的风险。单酶切时，就存在载体自连、无法指定方向的问题。
3、两种限制性内切酶切割，切割后形成的黏性末端不同，避免了由于相同的黏性末端碱基互补配对而出现质粒与质粒、目的基因与目的基因连接。因为用DNA连接酶连接时，除了缝合磷酸二酯键外，还要依靠相互间的碱基互补配对。
4、取下一段目的基因要切两次，也就是说这里切的两次可以分两种不同的酶来切，同样的，载体也需要切两次同样也是用这两种酶来切，这样有两组碱基的互补配对，就可以避免载体和载体配对以及目的基因和目的基因配对。
基因工程的农杆菌转化法的原理是什么
1、人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
2、农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞采用最多的方法。农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
3、双子叶植物或裸子植物受损伤时伤口处分泌酚类化合物，吸引农杆菌，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中与目的基因同时表达，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代。
4、农杆菌转化法详细过程如下：获得目的基因：用限制性内切酶切割目的基因。基因工程示意图。基因表达载体的构建：目的基因与载体（多为质粒）通过DNA连接酶连接。
5、因为农杆菌容易侵入生物的细胞，便于将目的基因带入生物体细胞，以便在生物体细胞内表达完成工程目的。
6、农杆菌能够将Ti质粒上的T-DNA以单链的形式整合到宿主基因组中，使得科学家开始用农杆菌介导法将外源的Bt基因、除草剂基因以及一些营养改良基因转入作物基因组，获得转基因作物。
